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HCV RNA - quantificare il virus nel sangue

HCV RNA: quantificare il virus nel sangue

Come, quando e perchè

Intervista Prof.ssa Riva Elisabetta

Responsabile Unità Operativa Semplice di Virologia
dell’Università Campus Bio-Medico di Roma

Dedichiamo questo spazio sul nostro notiziario a un tema molto importante nella vita di ogni malato, ancor di più se sta facendo il trattamento antivirale o se ha in programma di farlo.

Ci sono diversi motivi che ci spingono ad approfondire l’argomento. Durante le nostre consulenze quotidiane riceviamo molte richieste di chiarimento sulla corretta interpretazione dell’HCV RNA, delle sigle che accompagnano i numeri, e di altri aspetti che riguardano questo esame specifico. Oltre ciò, spesso notiamo che gli HCV RNA sono fatti al di fuori di trattamenti terapeutici, pratica assolutamente inutile e costosa.

Inoltre, le nuove molecole per il trattamento dell’epatite virale C saranno presto in commercio, e una delle problematiche di un centro specializzato sarà quella di poter disporre dei risultati della viremia in tempi utili per aderire correttamente agli schemi terapeutici. Significa avere risultati entro qualche giorno e questa è una specie di rivoluzione se consideriamo che moltissimi centri specializzati si dovranno adeguare a queste nuove modalità.

Approfondiamo questa tematica con la Prof.ssa Riva Elisabetta, Responsabile UOS di Virologia dell’Università Campus Bio-Medico di Roma.

Prof.ssa Riva può spiegare la differenza tra il test dell’HCV RNA Qualitativo e Quantitativo?
Entrambi sono metodi molecolari che rilevano la presenza dell’acido nucleico virale (quindi del virus HCV). Nel primo caso, ovvero con il test qualitativo, siamo in grado di rilevare solo la presenza o l’assenza dell’acido nucleico mentre il test quantitativo ci permette di fornire un numero ovvero di quantificare esattamente quanti acidi nucleici (teoricamente corrispondenti a particelle virali) sono presenti per millilitro di siero/plasma. Tale valore viene attualmente espresso in UI/mL (unità internazionali per millilitro).

Ci sono molti test per la quantificazione dell’HCV-RNA, quali sono i saggi più diffusi?
Ci sono molti test marcati CE-IVD (ovvero conformi alle norme europee e destinati all’uso diagnostico). La maggior parte dei saggi si basa sull’amplificazione molecolare di una sequenza virale specifica (presente nel genoma dell’HCV) attraverso PCR classica o RealTime (con rilevazione in tempo reale, RT-PCR)) PCR. Quest’ultimo metodo è sicuramente più sensibile della PCR classica ed ha un range di linearità notevolmente superiore. Siamo quindi passati da metodi quantitativi che avevano range di quantificazione compresi tra 600 e 5x105 (500.000) a metodi con range tra 15 e circa 107 (10.000.0000) UI/mL.  (tab1)
Al contrario dei test sopraelencati, i test come la bDNA (Branched DNA) non si basano sull’amplificazione di una sequenza genica del virus ma bensì sull’amplificazione del segnale di rilevazione. Rispetto ai metodi in PCR e RT-PCR, quest’ultimo metodo tende ad avere limiti di sensibilità superiori (ovvero limite inferiore di rilevabilità più elevato) pur essendo ugualmente attendibile dal punto di vista dei risultati (Tab 1)

Tabella 1 Principali test CE-IVD attualmente in commercio

Test

Metodo

Limiti di sensibilità e range di linearità in UI/mL

Amplicor HCV Monitor vs 2.0
(Roche)

PCR Competitiva
manuale

600-500,000

Cobas Amplicor HCV Monitor vs2.0 (Roche)

PCR Competitiva
semiautomatica

600-500,000

Versan HCV RNA 3.0 (Siemens)

bDNA

615-7,700,000

Artus HCV RG RealTime-PCR (Qiagen)

RealTime
Semiatomatica/automatica

65-1,000,000

Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HCV (Roche)

RealTime
automatica

15-10,000,000

RealTime HCV TaqMan (Abbott)

RealTime
Automatica/semiautomatica

12-100,000,000

Esempio di estrazione, amplificazione e quantificazione in RealTime (RT-PCR)

Tutti i metodi sopraelencati e comunemente utilizzati nei laboratori di diagnosi sono tutti altamente standardizzati ed automatizzati. Ciò riduce notevolmente l’errore legato all’operatore, alla variabilità della metodica e non da ultimo i tempi di lavorazione.

Quanto tempo ci vuole per avere il risultato della viremia?
Per l’esecuzione del test normalmente sono necessari circa 8-24 ore a seconda del test e della routine del laboratorio. Diverso è il concetto dei tempi di refertazione che in genere si allungano perché dipendono dalla quantità di lavoro a carico del laboratorio. Questo significa che per ottimizzare il lavoro da un punto di vista sia economico che gestionale è necessario cumulare campioni, il che generalmente porta a fare una seduta di viremie circa una volta alla settima. I tempi di refertazione vengono poi allungati a 15gg lavorativi per avere la possibilità di ripetere alcuni campioni se necessario.

Cosa significa “soglia di sensibilità”?
Sarebbe meglio parlare di limiti di rilevazione che corrispondono al il limite minimo e massimo entro il quale è possibile ottenere un dato quantitativo (ovvero un numero) con una probabilità uguale o superiore al 95%. Tali limiti vengono predeterminati dalla casa produttrice. (tabella 1).

Qual è la differenza tra la misurazione in copie/ml e UI/ml?
Fino a qualche tempo fa il risultato dei reagenti di riferimento e, di conseguenza, quello dei campioni in esame, veniva espresso in unità differenti (es equivalenti/mL, copie/mL, unità rilevabili in PCR/mL) nell’ambito delle diverse metodiche, rendendo difficile il confronto di dati ottenuti da laboratori diversi. La produzione di uno standard Internazionale, (il primo per HCV è stato prodotto dall’organizzazione mondiale della Sanità nel 1996) da utilizzare per la calibrazione dei reagenti di lavoro (controlli), ha permesso di esprimere i risultati ottenuti con test differenti in una unica unità di misura riconosciuta e valida a livello internazionale (UI = Unità Internazionali). Pertanto i dati espressi in UI/mL non rappresentano altro che la normalizzazione del dato in copie/mL rispetto allo standard internazionale.

Cos’è un “log”? Può spiegare come decifrare un risultato di viremia in relazione ai log/logaritmi?
Per “log” si intende logaritmo in base 10, è l’esponente che si deve dare alla base (in questo caso 10) per ottenere il numero.
5 log significa quindi 10 elevato alla 5 (105) ovvero (100.000).
Esempio. HCV RNA 340.000 UI/mL = 5,5 log UI/mL ovvero 10 elevato alla 5,5 quindi 5,5 è l’esponente che devo dare a 10 per ottenere 340.000
1 log = 101=10
2 log=102=100

1 log

2 log

3 log

4 log

5 log

101

102

103

104

105

10

100

1.000

10.000

100.000

Quando si parla di un calo di 2 log significa pertanto un calo di 100 volte, se partiamo da una viremia di 560.000 UI/mL = 5,75 log UI/mL arriveremo a 3,75 log ovvero 5600.

Esempio: valore base viremia

Calo 1 log

Calo 2 log

Calo 3 log

Calo 4 log

5.250.000  UI/ml

525.000

52.500

5250

525


Alcune persone ci hanno riferito di avere avuto esiti diversi per lo stesso esame (es. anticorpi ANTI HCV) facendo il test in laboratori diversi. C’è una spiegazione?
Nello screening degli anticorpi anti HCV (test eseguito generalmente tramite metodica EIA-saggio in immunoenzimatica) questo è un fenomeno che può accadere (anche se raro) soprattutto se ci si trova di fronte a valori che non sono francamente positivi (i cosiddetti “border line” o in zona grigia). La discordanza dei dati può pertanto dipendere dalla diversa sensibilità dei test utilizzati e dalla presenza di fattori interferenti nel siero che possono incidere in maniera diversa sulle differenti metodiche. Va tuttavia considerato che la positività ad uno screening anticorpale, che per sua natura è molto sensibile ma può peccare in specificità, andrebbe sempre confermata con test più specifici (RIBA o immunoblot).  L’uso combinato dei test permette in genere di fornire un risultato attendibile sia in termini di sensibilità che di specificità. Può tuttavia accadere che, anche utilizzando i due sistemi in successione, si abbia un risultato indeterminato. In questo caso è necessario ripetere il test dopo qualche mese o in alternativa eseguire il dosaggio dell’HCV RNA.

Alcune persone ci hanno riferito che si sono “ripositivizzati” dopo anni che erano negativi all’HCV RNA. Ci può essere una relazione con i nuovi strumenti di rilevazione più sensibili?
Non credo che il problema dipenda dalla sensibilità delle metodiche in quanto una ripositivizzazione in genere è accompagnata da livelli di HCV RNA elevati e dunque non compatibile con problemi di sensibilità. È difficile pensare, in assenza di terapia, che possano perdurare per anni bassi livelli di replicazione a meno che non ci si aspetti la possibilità di una infezione occulta nel fegato che venga successivamente riattivata (ma qui apriremmo un capitolo ad oggi oggetto di speculazione scientifica). Il problema della sensibilità andrebbe comunque escluso in quanto i vecchi metodi quantitativi, pur dotati di minore sensibilità, venivano affiancati da metodi qualitativi con sensibilità paragonabile a quella degli attuali metodi quantitativi. Di rilevante è ormai dato acquisito in letteratura che un HCV-RNA negativo a sei mesi dal termine di una terapia antivirale (risposta virologica sostenuta) rappresenta un marcatore assai affidabile di eradicazione a lungo termine di HCV (guarigione virologica), quasi nel 100 % dei casi.

Può capitare che lo strumento indichi la presenza di particelle virali anche se non riesce a quantificare il numero esatto di copie del virus? C’è una spiegazione?
Si, può capitare perché la sensibilità della metodica è tale da rilevare la presenza di virus ma non di quantificarlo. Ad esempio possiamo avere un HCV rilevato al di sotto delle 15 UI/mL. Ciò vuol dire che la mia metodica è in grado di rilevare solo valori uguali o superiori a 15 UI/mL con una probabilità uguale o superiore al 95% (vedi limiti di sensibilità sopracitati). Tutto ciò che si trova al di sotto di 15 in termini numerici (es 10 o 7) può essere rilevato ma non gli può essere attribuito un valore preciso. Rilevare la presenza del genoma virale (HCV-RNA) ma non poterlo quantificare equivale a fare una valutazione qualitativa del dato.

Si può affermare che i risultati dei test HCV RNA qualitativo, quantitativo e anticorpale sono attendibili al 100% o ci posso essere contaminazioni e quindi “falsi positivi”?
Se parliamo di specificità clinica (capacità di individuare correttamente un soggetto infetto) ed analitica (capacità di individuare correttamente la presenza del virus) nella maggior parte dei casi ci si avvicina molto al 100%.  I test attualmente in commercio vengono standardizzati per avere le dovute caratteristiche di sensibilità e specificità e includono sistemi di controllo interno che permettono di monitorare tutte le fasi della procedura consentendo di fornire un dato quali/quantitativo preciso e corretto. Il problema delle contaminazioni nei metodi molecolari esiste ma per come sono formulati oggi i kit commerciali e le relative metodiche (la maggior parte dei quali usa sistemi completamente chiusi ed automatizzati in cui viene ridotto al minimo sia l’errore dell’operatore che le eventuali contaminazioni) la possibilità di un simile evento è piuttosto rara. Bisogna tuttavia sottolineare che è fondamentale rivolgersi a laboratori qualificati e certificati che hanno esperienza decennale in materia e soprattutto che usano metodi ampiamente validati.

Quando si può considerare un valore di viremia basso, un valore medio od un valore elevato?
Non esistono in assoluto soglie che definiscono valori alti, valori medi e alti.  In assenza di terapia, in genere valori compresi tra >=103 e 104 UI/mL vengono considerati bassi, quelli intorno a 105 UI/mL medi e <=106 UI/mL alti ma sono considerazioni arbitrarie.

Valori viremia considerati bassi

Valori viremia considerati medi

Valori viremia considerati alti

Fino a 10.000  UI/mL 

Da 10.000 a 100.000  UI/mL 

Oltre 100.000

*Nota: La viremia non correla con la severità della malattia e non può essere considerato un indice di gravità

Prof.ssa Riva il Genotipo dell’HCV può variare nel tempo?
No il genotipo infettante rimane lo stesso per tutto il periodo dell’infezione a meno che una persona guarisca e successivamente si reinfetti con un genotipo diverso.

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